Die Transfektion ist eine Technik, mit der das genetische Material einer Zelle verändert wird. Das Verfahren ist bei einer Vielzahl von Zelltypen wirksam. Im Vergleich zu menschlichen Zellen lassen sich tierische Zellen leichter transfizieren. Allerdings weisen transfizierte menschliche Zellen eine geringere Lebensfähigkeit auf. Aus diesem Grund kann die Transfektion tierischer Zellen effizienter sein.
Transiente Transfektionstechniken
Durch transiente Transfektionstechniken wird ein genetisches Material für einen kurzen Zeitraum in eine Zelle eingebracht, ohne es in das Genom der Zelle zu integrieren. Dadurch wird verhindert, dass es während der Zellteilung von Generation zu Generation weitergegeben wird, wodurch es verloren gehen oder verdünnt werden kann. Es führt auch zu einer hohen Kopienzahl des transfizierten genetischen Materials, was zu einer hohen Proteinexpression führt.
Transiente Transfektionstechniken können für kurz- und langfristige Genexpressionsexperimente verwendet werden. Je nach Zelltyp und Reportergen können transiente Transfektionstechniken in nur 24 bis 96 Stunden Protein liefern. In der Regel werden sie für die Proteinproduktion in kleinem Maßstab eingesetzt. Diese Techniken sind besonders nützlich für die Untersuchung der Auswirkungen von Transfektionen bei Tieren.
Liposomale Reagenzien wurden bei Transfektionen eingesetzt, um die Effizienz des Prozesses zu erhöhen. Allerdings sind liposomale Reagenzien in tierischen Zelllinien weniger wirksam als nicht-liposomale Reagenzien. Dies ist auf die begrenzte Lebensdauer und Wachstumskapazität der Zellen zurückzuführen. Nicht-liposomale Reagenzien sind für die Transfektion primärer Säugetierzellen besser geeignet.
Transfektionstechniken verwenden physikalische Methoden wie die Elektroporation, um fremdes genetisches Material in eukaryontische Zellen einzubringen. Zu den physikalischen Transfektionsverfahren gehören die Elektroporation, die Mikroinjektion und die Genkanone. Zu den chemischen Verfahren gehören Transfektionsreagenzien auf der Basis kationischer Lipide, die Co-Präzipitation von Kalziumphosphat und Diethyldextran.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) hält die Zellen in den Geweben organisiert. Der A. tumefaciens-Stamm LBA4404 kann für transiente Transfektionstests verwendet werden. Das Zellkulturmedium muss es ermöglichen, dass Nährstoffe durch das Gewebe fließen können, um Fleisch zu produzieren. Diese Gerüste können entweder so beschaffen sein, dass sie sich beim Wachstum der Zellen auflösen, oder so, dass sie an Ort und Stelle bleiben. Die Porosität des Gerüsts ist ebenfalls eine entscheidende Komponente.
Nicht liposomale Reagenzien
Nicht liposomale Reagenzien werden für die Transfektion von Zellen verwendet. Liposomale Reagenzien haben jedoch eine höhere Transfektionseffizienz als nichtliposomale Reagenzien. Studien haben gezeigt, dass liposomale Reagenzien eine höhere Transfektionseffizienz haben als nicht-liposomale Reagenzien in verschiedenen Zelltypen, einschließlich immortalisierter menschlicher Zellen wie HeLa- und HepG2-Zellen.
Die Transfektionseffizienz hängt von der Herkunft der Zelllinie ab. So variiert die Transfektionseffizienz beispielsweise stark zwischen tierischen und menschlichen Zelllinien. In einer Studie wurde die Transfektionseffizienz in glatten Muskelzellen von Mensch und Ratte verglichen. Die Forscher stellten fest, dass die glatten Muskelzellen der Ratte besser auf die Transfektionsreagenzien ansprachen als menschliche Zellen.
Die Effizienz der Transfektion hängt auch von der Anzahl der Transfektionsziele ab. Bei einer stabilen Transfektion wird die in Zellen transfizierte DNA durch Bildung von Episomen in die zellulären Chromosomen integriert. Zellen, die stabil transfiziert wurden, können mit Hilfe selektierbarer Marker wie Adenosindesaminase oder Dihydrofolatreduktase identifiziert werden.
Transfektionsreagenzien auf nichtliposomaler Basis werden für die Transfektion von Säugetierzellen in Suspensionskultur verwendet. Sie sind für maximale Transfektionseffizienz und minimale Zytotoxizität formuliert. Außerdem sind sie für die Transfektion von Insektenzellen geeignet.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch mit dem kolorimetrischen MTT-Assay überwacht, um die Auswirkungen der Transfektionsmittel zu bewerten. AGS-Zellen, die mit Attractene(tm) transfiziert wurden, hatten eine Transfektionseffizienz von 29,5 % und einen MFI von 437,5 – weit höher als die niedrigste gemessene Transfektionseffizienz von 2,5 % und der höchste MFI. Die höchste Transfektionseffizienz wurde bei einem DNA/Reagenz-Verhältnis von 0,4 mg/1,5 mL erreicht.
Ein hochwertiges nicht-liposomales Transfektionsreagenz muss eine geringe Zytotoxizität aufweisen, für die zu transfizierenden Zelltypen geeignet sein und eine hohe Transfektionseffizienz ermöglichen. Ein gutes Reagenz sollte serumverträglich sein und eine Knockdown-Effizienz von mehr als 90 % bei mehreren Zelltypen aufweisen. Außerdem sollte es frei von tierischen Produkten sein.
Die Größe der Partikel in Transfektionsreagenzien kann die Effizienz der DNA-Übertragung beeinflussen. So können beispielsweise kationische Lipide negativ geladene DNA binden. Dies führt zur Bildung eines Komplexes zwischen der DNA und dem Liposom.
Tierische Zelllinien
Tierische Zelllinien können transfiziert werden, um genetisch veränderte Proteine in vitro zu exprimieren. Der Transfektionsprozess läuft in zwei Schritten ab. Der erste Schritt ist die Transfektion eines DNA- oder shRNA-Moleküls in eine Zelle. Sobald sich die DNA oder shRNA in der Zelle befindet, muss sie in den Zellkern integriert werden. Der zweite Schritt ist die Transfektion der Zellen mit einem Selektionsmittel.
Der Prozess der Auswahl einer Zelllinie kann langwierig sein. Es ist wichtig, Zelllinien zu wählen, die unter den gleichen Bedingungen stabil sind. Die Verwendung desselben Mediums und Serums wie das ursprüngliche Ausgangsgewebe kann dazu beitragen, die Eigenschaften der Zelllinie zu erhalten. Es ist auch hilfreich, wenn die Zelllinie in flüssigem Stickstoffdampf aufbewahrt wird. Wird die Zelllinie zu lange in Abwesenheit von flüssigem Stickstoff gekeult, verliert sie ihre Lebensfähigkeit.
Ein weiterer Ansatz ist die chemische Transfektion, die auf bestimmte Zellen oder Gene abzielen kann. Ihre Effizienz und Lebensfähigkeit machen sie zu einem nützlichen Instrument für Forschung und Biotechnologie. Zu den Vorteilen dieser Technik gehören eine hohe Transfektionseffizienz und minimale Zelltoxizität. Mit dieser Methode lassen sich stabile Zelllinien herstellen, die für die Gentherapie unerlässlich sind.
Die Transfektion wird in der Arzneimittelforschung und -entwicklung vielseitig eingesetzt und ist im Labor weit verbreitet. Sie kann entweder in vitro oder in vivo erfolgen. Bei der In-vitro-Transfektion werden Ladungsmoleküle in kultivierte Zellen eingebracht, bei der In-vivo-Transfektion werden sie in ein Zielgewebe übertragen. Viele Transfektionsprodukte und -kits sind für die Verwendung mit bestimmten Zelltypen optimiert.
Bei der stabilen Transfektion wird Plasmid-DNA in das Genom der Zelle eingeführt, wodurch eine Zellpopulation mit Fremd-DNA entsteht. Diese Fremd-DNA wird dann als Teil des Zellgenoms repliziert. Die Zellen exprimieren die fremde DNA und geben sie an künftige Generationen weiter. Die Zellen können sogar als eine neue Zelllinie betrachtet werden.
Lipofectamine STEM
Das Transfektionsreagenz Lipofectamine Stem ist ein vielseitiges Transfektionsreagenz für Gene Editing-Anwendungen. Es ermöglicht die gemeinsame Verabreichung von großen DNA-Plasmiden, RNAs und Proteinen. Diese Komponenten können effizient in menschliche Stammzellen eingebracht werden.
Für den Transfektionsprozess befanden sich die Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase und wurden in DMEM-Medium mit 5 % CO2 kultiviert. Vor der Transfektion wurde das verbrauchte Kulturmedium entfernt und ein frisches verwendet. Die Zellen wurden in eine 10-cm-Schale mit fünfhundert Zellen pro Schale gegeben. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem DNA-Lipofectamine 2000-Komplex transfiziert, indem dieser tropfenweise zu den Zellen in einer 10-cm-Schale gegeben wurde. Die Zellen wurden vorsichtig geschüttelt, um eine Durchmischung zu gewährleisten. Nach 48 Stunden wurde das serumfreie Kulturmedium ersetzt, und der Gentransfer wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüft.
Das Lipofectamine Stem Transfection Reagent ist für eine maximale Transfektionseffizienz bei verschiedenen Arten von Stammzellen optimiert. Es ist mit feederfreien Mediensystemen kompatibel und kann eine Transfektionseffizienz von bis zu 80% in pluripotenten Stammzellen erreichen. Das Reagenz enthält Lipiduntereinheiten, die in wässrigen Medien Liposomen bilden können. Dies ermöglicht den Einschluss der Transfektionsnutzlast und unterstützt ihre weitere Vermehrung.
Lipofectamine STEM erwies sich bei der Übertragung von Genen auf SSCs als effizienter als Elektroporation. Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm in den mit Lipofectamin transfizierten Zellen stärker zu. Darüber hinaus ergab die Lipofectamin-Transfektion im Vergleich zur Elektroporation einen höheren Prozentsatz an eGFP-exprimierenden SSC-Kolonien.
Ähnliche Themen
